本应用介绍了在生物医疗领域，利用µ-SlideILuer 08通道载玻片（ibidi，货号80196）进行细菌生物膜的静态培养，同时采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和扫描电子显微镜（SEM）进行联合成像的实验方案。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa DSM50071T）被接种至µ-SlideILuer 08通道载玻片中，经过三天的培养。为提升细胞贴壁与表面生物膜的形成，培养约36小时后更换培养基，以去除游离细胞。为验证生物膜的形成，在生长培养基中添加了无毒的光学示踪剂EbbaBiolight680。该试剂适合活细胞成像，当与细胞外基质中的蛋白质及多糖结合时，能发出红色荧光，便于细菌生物膜的可视化分析。

通过DAPI染色并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的观察结果表明，细菌细胞能够附着并形成单层或双层结构。运用光学示踪剂发出的荧光信号增强，可以识别出更厚的生物膜结构。此实验旨在同一载玻片上结合多种成像技术。在进行CLSM成像后，还需对细胞进行固定，随后进行脱水处理并干燥，以便后续的扫描电子显微镜（SEM）成像。实验室使用自制3D模具来分离盖玻片，确保在操作过程中不损坏贴壁细胞的空间结构。最后，在分离的盖玻片上进行2000倍至15000倍的放大成像，以观察细菌的详细结构。

材料与试剂

• 铜绿假单胞菌培养物（Pseudomonas aeruginosa culture，DSMZ，50071）
• 胰蛋白酶胨（Thermo Fisher Scientific，211705）
• 大豆蛋白胨（Millipore，107212）
• 葡萄糖（VWR，24379）
• 氯化钠（VWR，27800）
• 磷酸氢二钾（K2HPO4，Sigma，P3786）
• 磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma，P7994）
• EbbaBiolight680（Ebba Biotech AB）
• 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, stock concentration 1mg/mL, Thermo Fisher Scientific, 62248)
• 25%戊二醛（Sigma，G7776）
• 去离子水（diH2O）
• 无水乙醇（Sigma，34852-M）

实验步骤

细菌生物膜附着

操作前请详细阅读µ-SlideILuer 08的说明书，并遵循通用的移液及液体更换建议，确保所有步骤均在无菌条件下进行。实验开始前，将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa DSM50071）接种于LB培养基中，在30°C、160转/分钟的条件下避光振荡培养过夜。根据供应商协议，将培养物以1:100的比例稀释于含有1:1000光学示踪剂的培养基中。

为确保µ-Slide的有效使用，须将所需材料放置于30°C培养箱中过夜，使其平衡。此举可防止后续操作时因温差产生的气泡。随后，按照说明书的指导，将200µL的稀释菌液注入µ-SlideILuer 08通道载玻片，并用随附的盖子密封。

在室温避光环境中静置两小时，让细胞沉降并附着。接着向每个储液池中加入60µL含有光学示踪剂的TSB培养基，并用盖子封闭储液池。再将µ-Slide在30°C避光条件下静置培养1-2天。期间，按说明书从一侧储液池吸取100µL液体，并加入100µL新鲜配制的含光学示踪剂的TSB培养基，重复此步骤10次以确保培养基的更换彻底，避免气泡的形成。最后，将储液池注入60µL无细胞补充的TSB培养基，再次在30°C避光条件下孵育1至2天，以进一步促进细胞的贴壁及生物膜的形成。

DAPI染色及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察

染色过程直接在µ-SlideILuer 08中进行，同样务必在通风橱内完成，避免一次性移除通道内全部液体以防细胞干燥。首先，从一侧储液池移除100µL培养基，向另一侧加入100µL 1×PBS冲洗液，重复此步骤5-10次，直至培养基完全被1×PBS替代。接下来，用DAPI染色液替换1×PBS，确保通道完整充满，在室温避光环境下孵育10分钟。

之后，使用去离子水冲洗两次以去除多余染料，并最终用1×PBS冲洗一次。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）拍摄附着的细胞，为接下来的SEM成像准备样品。成像后，将µ-Slide置于4°C冷藏，保存时间最长可达2天，供后续处理。

SEM样品制备

样品制备同样在µ-SlideILuer 08中进行，务必在通风橱内进行。固定步骤需参照DAPI染色步骤，将通道及储液池内的1×PBS替换为含25%戊二醛的1×PBS溶液，以固定贴壁细胞。接着在室温下孵育3-4小时（或4°C过夜），用1×PBS冲洗至少5次以彻底去除戊二醛。实施梯度脱水，依次用30%、50%、70%、90%无水乙醇孵育15分钟每次，并最终用100%乙醇处理两次，每次20分钟。随后，将通道载玻片置于55°C培养箱中，无需盖上盖子，直至液体完全蒸发（通常需2小时）。

成功脱水后，将µ-Slide保存于干燥器中等待后续处理。按照设计图使用手术刀或刀片切割载玻片，并将切割后的载玻片竖直存放在干燥器内（可保存数周），随后对每个约1cm的小段进行镀金处理，以备电镜观察。

在细菌生物膜的研究与成像中，借助尊龙凯时（中国区）的人生就是搏理念，我们能够更深入地探讨细菌的生物膜特性以及它们在生物医学中的重要应用。通过这种多种成像技术的结合，能够更有效地促进微生物生物膜在医学研究领域的应用，推动生物医学技术的进步。