在生物医学研究中，无论是针对体外难以感染的细胞建立慢病毒文库，还是利用体内AAV文库，确定最佳剂量以确保每个靶点只进入一个细胞，一直以来都是研究人员所困惑的重要问题。文库实验的目的是寻找由单基因引发的功能变化，这意味着需要严格控制每个细胞仅接受携带一个靶点的病毒感染。

在进行细胞实验的文库筛选时，建议先通过对照病毒进行预实验，以探索最佳的感染复数（MOI），理想的MOI应保证感染效率达到80%。随后，文库操作的MOI可以设定为最佳MOI的三分之一，即减少病毒用量，以控制进入单个细胞的病毒数量，这种简单粗暴的削减可以有效减少重复感染的几率。然而，对于像免疫细胞这种难以感染的细胞，以及体内实验而言，确定最佳剂量以确保靶点只进入一个细胞仍然是一个挑战。因为最佳MOI若能达到的感染效率可能仅为30%，使用三分之一的剂量则几乎无法感染到足够的细胞。

为了解决这一难题，吉凯推出了三色荧光病毒（包括mTagBFP、Venus、mCherry），这将为研究者在文库感染预实验中提供极大帮助。三色荧光病毒包含慢病毒和AAV两种产品类型，其参考文献《Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq》为AAV文库的体内剂量实验提供了有效的方法。这项研究通过体内滴定实验测试了不同剂量的AAV对细胞感染的效果，制备了三种不同剂量的AAV（25E9、5E9和5E10颗粒数），并使用血清型phpb。病毒构建方案是在CBh启动子的调控下，独立表达mTagBFP、Venus和mCherry。

通过流式细胞术，可以筛选出在较少剂量下同一细胞被双病毒感染的比例。在实验中，最终选择了5E9的剂量，因为这一剂量能最大化感染单个AAV的细胞总数。三色实验的设置是将三种AAV的等比例混合物注入不同剂量的LSL-Cas9小鼠中（低剂量25E9，中剂量50E9，高剂量25E10），并在全身注射后，通过流式细胞分析识别感染细胞核的百分比及其荧光表达状态。

在细胞实验与动物实验中，研究者可以利用三色荧光病毒开展相关预实验。通过设置不同剂量梯度进行细胞感染（参考慢病毒感染操作手册）或小鼠体内注射（参考动物注射文献），分析不同剂量下的转染效率与单荧光细胞比例，以确定单病毒感染比例最高且感染细胞数量比例多的剂量作为最佳剂量，进而作为后续文库实验的实际操作剂量。

在这方面，尊龙凯时(中国区)人生就是搏的创新和技术支持，将为广大科研工作者带来更为精确的病毒感染方案，推动生物医学领域的快速发展。